Première : une étude démontre qu'il est possible de détruire la protéine de pointe du covid 19 et celles injectées dans les vaccins

Beaucoup s'inquiètent, vaccinés ou non, de savoir comment détruire la protéine de pointe du covid 19 et celles injectées dans les vaccins. Une étude japonaise intitulée "Effet dégradant de la nattokinase sur la protéine de pointe du SRAS-CoV-2" sur 12 hommes japonais, jeunes et en bonne santé, a révélé que déjà une dose unique de 2000 FU de "nattokinase" active plusieurs voies fibrinolytiques et antithrombotiques. Pour ceux qui veulent lire cette étude scientifique :

Résumé

La maladie à coronavirus 2019 (COVID-19), causée par le coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SARS-CoV-2), est apparue comme une pandémie et a infligé d'énormes dommages à la vie des personnes et à l'économie de nombreux pays du monde. Cependant, les agents thérapeutiques contre le SRAS-CoV-2 restent flous. Le SRAS-CoV-2 possède une protéine de pointe (protéine S), et le clivage de la protéine S est essentiel à l'entrée virale. La nattokinase est produite par Bacillus subtilis var. nattoet est bénéfique pour la santé humaine. Dans cette étude, nous avons examiné l'effet de la nattokinase sur la protéine S du SRAS-CoV-2. Lorsque les lysats cellulaires transfectés avec la protéine S ont été incubés avec la nattokinase, la protéine S a été dégradée de manière dépendante de la dose et du temps. L'analyse par immunofluorescence a montré que la protéine S à la surface des cellules était dégradée lorsque la nattokinase était ajoutée au milieu de culture. Ainsi, nos résultats suggèrent que la nattokinase présente un potentiel d'inhibition de l'infection par le SRAS-CoV-2 via la dégradation de la protéine S.

1. Introduction

La maladie à coronavirus 2019 (COVID-19), causée par le coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS-CoV-2), s'est propagée dans le monde entier. La pandémie de COVID-19 a touché plus de 437 millions de personnes et causé plus de 6,3 millions de décès ( https://covid19.who.int/, consulté le 4 juillet 2022). L'entrée du SRAS-CoV-2 dans les cellules hôtes est médiée par la protéine de pointe transmembranaire (protéine S), qui forme des homotrimères qui s'étendent à partir de l'enveloppe virale. La protéine S est transformée et activée par des protéases cellulaires, notamment la protéine sérine transmembranaire 2 (TMPRSS2), la cathepsine et la furine. Il comprend deux sous-unités fonctionnelles, S1 et S2 ; la sous-unité S1 du SRAS-CoV-2 initie la liaison virus-récepteur en interagissant avec l'enzyme de conversion de l'angiotensine 2 (ACE2) du récepteur de la cellule hôte humaine, et la sous-unité S2 participe à la fusion virale avec la cellule cible, permettant l'entrée virale [ 1 ] . Le domaine de liaison au récepteur (RBD) dans la sous-unité S1 est responsable de la liaison à l'ACE2. Le clivage de la protéine S se produit à la frontière entre les sous-unités S1 et S2.

Actuellement, de nombreux pays sont impliqués dans le développement de vaccins pour se protéger contre l'infection par le SRAS-CoV-2, ainsi, le nombre d'infections par le SRAS-CoV-2 a diminué. Cependant, de nombreuses variantes du SRAS-CoV-2, y compris des souches avec des épitopes cibles vaccinaux mutés, ont été signalées [ 2 , 3 ]. La vaccination peut ne pas protéger complètement contre l'infection par le SRAS-CoV-2 car le nombre de patients atteints de COVID-19 augmente après la vaccination. Par conséquent, il est important de développer de nouveaux traitements pour les infections par le SARS-CoV-2.

Le natto est un aliment japonais traditionnel populaire à base de soja fermenté par Bacillus subtilis var. natto . La nattokinase se trouve dans le natto [ 4 ] et est l'une des enzymes extracellulaires les plus importantes produites par B. subtilis var. natto [ 5 ]. La nattokinase est constituée de 275 acides aminés et pèse environ 28 kDa [ 6 , 7 ]. La nattokinase inactive l'inhibiteur de l'activateur du plasminogène-1 et augmente la fibrinolyse [ 8 ]. Il diminue également les taux plasmatiques de fibrinogène, de facteur VII, de cytokines et de facteur VIII [ 9]. La nattokinase a le pouvoir de dissolution des caillots le plus élevé parmi les anticoagulants naturellement connus [ 10 ]. Un essai clinique a démontré que la consommation orale de nattokinase n'était associée à aucun effet indésirable [ 11 ]. Ainsi, la nattokinase est maintenant considérée comme une enzyme efficace, sûre et économique qui a attiré l'attention dans les études sur les médicaments thrombolytiques [ 12 , 13 ]. De plus, la nattokinase est utilisée dans le traitement de certaines tumeurs [ 14 , 15 ].

Une étude récente a révélé que l'extrait de natto inhibe l'herpèsvirus bovin 1 (BHV-1) et l'infection par le SRAS-CoV-2 [ 16 ]. Ces résultats indiquent que la protéase d'extrait de natto pourrait être efficace contre l'infection par le SRAS-CoV-2. Dans cette étude, nous avons cherché à déterminer si l'inhibition de l'infection par le SRAS-CoV-2 par l'extrait de natto est causée par la nattokinase dérivée de B. subtilis var. natto .

2. Résultats et discussion

2.1. Effets dégradants de la nattokinase sur la protéine de pointe du SRAS-CoV-2 in vitro

Nous avons d'abord étudié si la nattokinase dans l'extrait de natto pouvait dégrader la protéine S du SRAS-CoV-2. La protéine S du SRAS-CoV-2 joue un rôle important dans le récepteur ACE2 de la cellule hôte au cours des premiers stades de l'infection [ 17 ]. Après avoir mélangé le lysat cellulaire d'expression de la protéine S avec une série de dilutions de 4 fois de nattokinase (32 µg/mL, 8 µg/mL, 2 µg/mL, 500 ng/mL, 125 ng/mL, 31,25 ng/mL et 7,8125 ng/mL), Western blot a été réalisé. La longueur totale de la protéine S (sous-unités S1 et S2) et de la sous-unité S2 est apparue sous forme de bandes lorsque le lysat de cellule d'expression de la protéine S a été incubé avec du D-PBS à des concentrations de nattokinase de 500 ng/mL, 125 ng/mL, 31,25 ng/mL et 7,8125 ng/mL ( Figure 1 UN). Ensuite, nous avons examiné si la nattokinase dégrade la protéine S de manière dépendante du temps. Le lysat a ensuite été incubé avec 1 µg/mL de nattokinase pendant 10 à 180 min. La protéine S du SRAS-CoV-2 a été dégradée par la nattokinase après 60 à 180 min d'incubation, mais pas après 10 et 30 min d'incubation ( Figure 1 B). Ainsi, la nattokinase a dégradé la protéine S de manière dépendante de la dose et du temps.

Pour confirmer si l'effet dégradant de la nattokinase est dû à l'activité enzymatique, la nattokinase a été traitée par chauffage ou avec un cocktail d'inhibiteurs de protéase. Lorsque la nattokinase a été chauffée à 100 ° C pendant 5 min, l'effet dégradant de la nattokinase a été perdu ( figure 1C , voie 6). De plus, la perte des bandes de protéine S par la nattokinase a été bloquée lorsque des inhibiteurs de protéase ont été ajoutés ( figure 1C , voies 4 et 5). Comparé au cocktail inhibiteur de protéines I, au cocktail de protéines III, composé d'AEBSF HCl (chlorhydrate de fluorure de 4-(2-aminoéthyl) benzènesulfonyle), d'aprotinine, qui est un inhibiteur irréversible de sérine protéase, et de leupeptine, qui est une cystéine-protéase, clairement bloque l'activité de la nattokinase. La nattokinase a les mêmes acides aminés conservés, Ser-His-Asp (Asp³² , His ⁶⁴ et Ser ²²¹ ), qui sont des membres de la famille subtilisine des sérine protéases [ 6 , 18 ]. La structure cristalline de la nattokinase est presque identique à celle de la subtilisine E de B. subtilis DB104 [ 19 ]. Ce résultat est cohérent avec celui d'un rapport précédent selon lequel la nattokinase est une sérine protéase. Nous avons également évalué les effets dégradants de la nattokinase à l'aide de lysats cellulaires exprimant le RBD et l'ACE2. Lorsque 7,5 µg/mL de nattokinase et de lysat cellulaire ont été incubés, les bandes de RBD et ACE2 ont été perdues ( Figure 1 D).

2.2. Effets dégradants de la nattokinase sur la protéine de pointe du SRAS-CoV-2 à la surface des cellules transfectées

Ensuite, nous avons examiné si la nattokinase dégrade la protéine S sur la surface cellulaire transfectée. La protéine S a été transfectée avec les cellules HEK293. Les cellules transfectées ont été incubées avec de la nattokinase pendant 9 h. La protéine S sur la surface cellulaire a été détectée à l'aide d'un anticorps anti-protéine S sans perméabilisation cellulaire ( Figure 2 A). La protéine S a été détectée dans les cellules transfectées. Lorsque les cellules transfectées ont été traitées avec de la nattokinase, la protéine S à la surface des cellules a diminué. Lorsque les cellules ont été traitées avec 25 µg/mL et 2,5 µg/mL de nattokinase, le rapport entre la zone positive pour la protéine S et la zone positive pour le noyau a diminué d'environ 0,3 et 0,7, respectivement ( figure 2 B). L'effet dégradant de la nattokinase a été observé en l'absence de cytotoxicité (Figure 2C). L'analyse Western blot a montré que la quantité de protéine S totale ne changeait pas entre les traitements de nattokinase et de contrôle ( Figure supplémentaire; Figure S1 ). Ces résultats indiquent que la nattokinase dégraderait la protéine S du SRAS-CoV-2 dans la plage de concentration non toxique.

Dans cette étude, nous avons montré que l'activité protéasique de la nattokinase contribue à la dégradation de la protéine S. La nattokinase a un effet dégradant non seulement sur les protéines S mais aussi sur l'ACE2 dans les cellules hôtes. La spécificité de la protéase de la nattokinase serait faible, car GAPDH, une protéine domestique, a également été dégradée simultanément lors de l'évaluation in vitro de la nattokinase mélangée à un lysat cellulaire ( Figure supplémentaire; Figure S2 ). D'autre part, lorsqu'il est ajouté aux cellules, il ne montre aucun effet sur la viabilité cellulaire et devrait agir comme agent protecteur à la surface des cellules. Une analyse plus approfondie des produits de dégradation de la nattokinase à l'aide de la spectrométrie de masse est nécessaire pour comprendre les effets de la protéolyse.

La nattokinase possède la puissante activité de dégradation de la protéine S du SRAS-CoV-2 et il a également été démontré qu'elle exerce des effets anti-athéroscléreux, hypolipémiants, antihypertenseurs, antithrombotiques, fibrinolytiques, neuroprotecteurs, antiplaquettaires et anticoagulants [ 20 ]. Les patients souffrant d'hypertension et de comorbidités cardiovasculaires peuvent facilement tomber très malades à cause du COVID-19 [ 21 ]. En raison de l'émergence de nombreuses variantes du SRAS-CoV-2, y compris des souches avec des épitopes cibles vaccinaux mutés, la vaccination seule peut ne pas protéger complètement contre l'infection par le SRAS-CoV-2. Les extraits de nattokinase et de natto ont le potentiel d'être développés en tant que nouvelle génération de médicaments pour la prévention et le traitement du COVID-19.

3. Matériels et méthodes

3.1. Matériaux

La nattokinase a été obtenue auprès de Contek Life Science Co., Ltd. (Taipei City, Taiwan). L'activité nattokinase était de 60 000 FU/g (FU, unité de fibrinolyse). Les ensembles de cocktails d'inhibiteurs de protéase I et III ont été achetés auprès de FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation (Osaka, Japon). Le plasmide d'expression (pcDNA3.1-SARS2-Spike C9 avec étiquette au C-terminal, pcDNA3.1-hACE2 et pcDNA3-SARS-CoV-2-S-RBD-sfGFP) a été acheté chez Addgene (Watertown, MA, ETATS-UNIS). Les cellules HEK293 (JCRB9068) ont été obtenues auprès de la JCRB Cell Bank (Osaka, Japon).

3.2. Culture cellulaire et transfert Western

Les cellules HEK293 ont été cultivées à une densité de 3,5 × 10 ⁵ cellules/mL dans du DMEM additionné de 10 % de FBS, de L-glutamine, de pénicilline 100 U/mL et de streptomycine 100 μg/mL pendant la nuit. Les cellules ont été transfectées avec chaque plasmide (pcDNA3.1-SARS2-Spike, pcDNA3-SARS-CoV-2-S-RBD-sfGFP ou pcDNA3.1-hACE2) et incubées pendant 22 h. Après incubation, les cellules cultivées ont été grattées et lavées avec une solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco glacée (D-PBS). Le comptage des cellules a été effectué et le tampon xTractor (Takara Bio Inc., Shiga, Japon) a été ajouté au précipité cellulaire. Les lysats cellulaires ont été centrifugés à 1300× gpendant 10 min à 4 ° C et le surnageant a été transféré dans de nouveaux tubes et stocké à -80 ° C jusqu'à utilisation. La concentration en protéines a été déterminée par dosage de protéines à l'acide bicinchoninique (BCA) à l'aide d'un kit de dosage BCA (Takara). Dix microlitres de nattokinase et 10 µL de lysat cellulaire (1 µg/mL) ont été incubés à 37 °C pendant 1 h. Lorsque les effets des inhibiteurs de protéase ont été utilisés, les ensembles de cocktails d'inhibiteurs de protéase I et III ont été dilués 10 fois avec du D-PBS, et une solution de cocktail d'inhibiteur de protéase de 10 µL a été ajoutée au mélange de nattokinase et de lysat cellulaire. Des volumes égaux du mélange réactionnel ont été chargés et un Western blot a été effectué. Les anticorps primaires comprenaient l'anticorps monoclonal de souris anti-rhodopsine (C9) (1D4) (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA), l'anticorps monoclonal de souris anti-GAPDH (FUJIFILM Wako), anticorps monoclonal de souris anti-étiquette GFP (Proteintech, Rosemont, IL, USA) et anticorps anti-ACE2 (Proteintech). Les anticorps secondaires comprennent un anticorps anti-souris de chèvre conjugué à la HRP (Proteintech).

3.3. Test d'immunofluorescence

Les cellules HEK293 ont été cultivées à une densité de 3,5 × 10 ⁵cellules/mL dans une chambre à 8 puits dans du DMEM additionné de 10 % de FBS, de L-glutamine, de pénicilline 100 U/mL et de streptomycine 100 μg/mL. Les cellules ont été transfectées avec pcDNA3.1-SARS2-Spike et incubées pendant 9 h. Après incubation, les cellules ont été traitées avec les échantillons, incubées pendant 13 h et fixées dans du paraformaldéhyde à 4 % pendant 30 min. Après incubation avec l'anticorps monoclonal de pointe SARS-CoV/SARS-CoV-2 (1A9) (GeneTex, CA, USA) pendant 1 h, il a été incubé avec un anticorps anti-souris de chèvre conjugué à Cy3 pendant 1 h. Les lames ont été colorées avec DAPI Fluoromount-G et observées à l'aide d'un microscope à fluorescence (BZ-X710, Keyence, Osaka, Japon). Les zones positives pour la protéine S et positives pour le noyau ont été calculées à l'aide du logiciel d'analyse joint BZ-X710 (analyseur BZ-X). La viabilité cellulaire a été évaluée à l'aide du test de bromure de 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényltétrazolium (MTT). Les cellules ont été cultivées dans des plaques de culture à 24 puits. Après incubation à 37 °C pendant 24 h, des échantillons ont été ajoutés à chaque puits et incubés pendant 13 h supplémentaires. Les cellules ont été mises en suspension dans 500 μL de DMEM contenant 500 μg/mL de MTT. Après incubation pendant 3 h à 37 ° C, 500 μL d'isopropanol contenant 4 mM de HCl ont été ajoutés pour dissoudre le formazan MTT. L'absorbance a été mesurée à 570 nm à l'aide d'un lecteur de microplaques.

4. Conclusions

Dans cette étude, nous avons démontré que la nattokinase, une sérine protéase, dégrade la protéine S du SRAS-CoV-2. Pour déterminer si la nattokinase contenue dans l'extrait de natto pouvait inhiber l'infection par le SRAS-CoV-2, nous avons analysé la dégradation de la protéine S en mélangeant le lysat de cellules d'expression de la protéine S et la nattokinase d'une manière dépendante de la dose et du temps. Le RBD de la protéine S se lie à la partie distale de la membrane de la protéine ACE2. Il a été rapporté que l'extrait de natto inhibe l'infection par le SRAS-CoV-2 dans les cellules Vero E6 via la dégradation de la RBD [ 16]. Nous avons démontré que la dégradation de la protéine S par la nattokinase était bloquée par des traitements thermiques ou inhibiteurs de protéines. Nos données suggèrent que l'activité protéasique de la nattokinase joue un rôle crucial dans la dégradation de la protéine S. Pris ensemble, ces découvertes supportent la notion que l'inhibition de l'infection SARS-CoV-2 par l'extrait de natto était due à la dégradation de la protéine S par la nattokinase. Ainsi, nos données ont indiqué que les extraits de nattokinase et de natto ont des effets potentiels sur l'inhibition de l'entrée de la cellule hôte du SRAS-CoV-2 via la dégradation de la protéine S.

Matériel supplémentaire

Les informations complémentaires suivantes peuvent être téléchargées à l'adresse : https://www.mdpi.com/article/10.3390/molecules27175405/s1 , Figure S1 : l'effet de l'ajout de nattokinase au milieu de culture cellulaire exprimant la protéine S a été évalué par transfert Western ; Figure S2 : Effets dégradants de GAPDH in vitro.

Les contributions de l'auteur

Conceptualisation et supervision, TT, JY, KH, SC, AI, TY, RS, YI et MK ; Méthodologie, tous auteurs; Western blot et analyses immunofluorescentes, TT, YK et MK ; rédaction—préparation du brouillon original, TT et MK ; rédaction—révision et édition, tous les auteurs. Tous les auteurs ont lu et accepté la version publiée du manuscrit.

Financement

Cette recherche n'a reçu aucun financement externe.

Déclaration du comité d'examen institutionnel

N'est pas applicable.

Déclaration de consentement éclairé

N'est pas applicable.

Déclaration de disponibilité des données

Les données utilisées pour étayer ces conclusions ont été incluses dans cet article. Des informations supplémentaires sont disponibles sur demande auprès des auteurs correspondants.

Les conflits d'intérêts

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d'intérêt.

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Figure 1. ( A ) Effets dégradants de la nattokinase de manière dose-dépendante. La nattokinase diluée en série (32 µg/mL, 8 µg/mL, 2 µg/mL, 500 ng/mL, 125 ng/mL, 31,25 ng/mL et 7,8125 ng/mL) a été mélangée avec un lysat cellulaire d'expression de la protéine S et incubée . La longueur totale de la protéine S (sous-unités S1 et S2) et de la sous-unité S2 a été détectée comme bandes supérieure et inférieure, respectivement. Le rapport de S total a été indiqué comme la quantité relative de protéine S (protéine S + protéine S2). ( B ) Effets dégradants de la nattokinase de manière dépendante du temps. Le lysat de cellules d'expression de la protéine S a été incubé avec 1 µg/mL de nattokinase pendant 0, 10, 30, 60, 120 et 180 min. ( C) Effets du traitement thermique ou des inhibiteurs de protéase. Piste 1 : lysat HEK293 ; piste 2 : lysat HEK293 (protéine S) ; piste 3 : HEK293 (protéine S) + nattokinase (5 µg/mL) ; piste 4 : HEK293 (protéine S) + nattokinase (5 µg/mL) + inhibiteur de protéase I ; piste 5 : HEK293 (protéine S) + nattokinase (5 µg/mL) + inhibiteur de protéase III ; ligne 6 : HEK293 (protéine S) + nattokinase traitée thermiquement (5 µg/mL). ( D ) Effet dégradant sur le RBD de la protéine S et de l'ACE2. La RBD de la protéine S et les plasmides codant pour l'ACE2 ont été transfectés avec des cellules HEK293, respectivement. Les lysats cellulaires ont été incubés avec de la nattokinase (7,5 µg/mL) et de la nattokinase traitée thermiquement (7,5 µg/mL) et un transfert Western a été effectué.

Figure 2. ( A ) Effet dégradant de la nattokinase sur la protéine S à la surface cellulaire. Spike-pcDNA3.1 a été transfecté avec des cellules HEK293 et ​​incubé pendant 9 h. Après incubation, de la nattokinase (25 et 2,5 µg/mL) a été ajoutée au milieu de culture et encore incubée pendant 13 h. Les cellules ont été fixées et une analyse par immunofluorescence a été effectuée. La protéine S à la surface de la cellule a été colorée avec un anticorps anti-protéine de pointe (rouge) et le noyau a été coloré avec du DAPI (bleu). ( B ) Rapport de la surface de la protéine S à la surface du noyau positif. Trois images par échantillon ont été capturées et les zones positives de protéine S/noyau ont été calculées. Les données sont présentées sous forme de moyenne + SD, et p-la valeur a été déterminée par analyse de variance unidirectionnelle (ANOVA) avec le test post-hoc de Tukey en utilisant le logiciel R (R-3.3.3 pour les fenêtres) (** p < 0,01 ; *** p < 0,001). ( C ) La viabilité cellulaire a été évaluée par le test MTT. La nattokinase indiquée a été ajoutée au milieu de culture et incubée pendant 13 h ; Le test MTT a été 
réalisé.

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