Bien que puissantes, l'optogénétique et la chimiogénétique ne sont pas sans limites. L'optogénétique nécessite généralement l'implantation de fibres optiques dans le cerveau, ce qui la rend hautement invasive. Avec la chimiogénétique, le médicament de synthèse est administré de manière systémique et à action lente, cette méthode n'est donc pas adaptée pour engager une dynamique rapide et précise. Une approche alternative est la magnétogénétique, qui utilise des canaux de potentiel de récepteur transitoire (TRP) transduits par voie virale tels que TRPV1 et TRPV4 pour permettre le contrôle de l'activité cellulaire avec un champ magnétique. [14-19] L'action est médiée par le champ magnétique. nanoparticules (MNP) qui sont attachées aux canaux TRP, et deux stratégies ont été utilisées pour déclencher l'ouverture des canaux. L'une consiste à utiliser un canal TRP sensible à la température, qui peut être activé en chauffant les MNP attachés avec un champ magnétique alternatif radiofréquence (AMF).[14-18] L'autre consiste à utiliser un canal TRP mécanogéné, qui peut être ouvert en exerçant une force sur les MNP attachés avec un champ magnétique inhomogène. [16, 17, 19] La magnétogénétique permet un contrôle à distance car les champs magnétiques subissent très peu d'atténuation par les tissus biologiques, ils peuvent donc être appliqués aux structures profondes de l'extérieur. Cependant, on craint que le contrôle magnétogénétique de la fonction cellulaire soit difficile à réaliser[20] et que les mécanismes sous-jacents ne soient pas clairs.[21] De plus, l'optogénétique, la chimiogénétique et la magnétogénétique nécessitent toutes l'expression d'une protéine exogène dans les cellules d'intérêt, une intervention qui a des conséquences peu claires sur la sécurité, en particulier à long terme, et représente un obstacle majeur à la traduction de ces technologies en clinique. [22, 23]Ici, nous introduisons la stimulation magnétomécanique (MMS) en tant que technologie de contrôle cellulaire sélective basée sur le magnétisme qui n'implique pas de modification génétique et confère donc l'avantage du contrôle à distance ainsi que l'avantage supplémentaire de la simplicité en termes de convivialité et de mécanisme sous-jacent. La sensibilité aux stimuli mécaniques est une caractéristique endogène des astrocytes. Par exemple, toucher des astrocytes en culture avec une micropipette provoque une élévation de la concentration intracellulaire de Ca2+ ([Ca2+]i)[24, 25] et de la libération d'ATP.[26, 27] En exploitant une telle mécanosensibilité, nous démontrons la faisabilité de déclencher à distance le Ca2+ astroglial et La signalisation ATP par MMS, qui consiste à cibler des particules d'oxyde de fer magnétique fonctionnalisées par des anticorps vers les astrocytes et à appliquer un champ magnétique pour exercer des forces sur les particules et stimuler mécaniquement les cellules. En plus d'être un outil de recherche utile pour disséquer les rôles fonctionnels des astrocytes dans les circuits neuronaux, l'élimination du besoin de modification génétique ferait également du MMS un candidat plus attrayant pour la traduction clinique que les méthodes génétiques.
Pour développer le MMS, nous avons d'abord déterminé les stimuli mécaniques minimaux requis pour déclencher la signalisation Ca2+ et ATP dans les astrocytes à l'aide d'un dispositif sur mesure capable d'appliquer des forces précises. Ensuite, nous avons évalué une série de particules magnétiques et en avons sélectionné une sous-micrométrique qui permettait un MMS efficace et sélectif, après avoir étudié divers facteurs, notamment la taille et les propriétés magnétiques des particules, le degré d'agrégation des particules sur les cellules et le type de ligand conjugué. aux particules. Ensuite, nous avons conçu et testé un dispositif magnétique capable de produire les stimuli mécaniques requis dans le cerveau d'un petit rongeur. Enfin, en utilisant soit le dispositif magnétique spécialement conçu à cet effet, soit le champ magnétique périphérique d'un scanner IRM pour actionner des particules conjuguées à un anticorps spécifique aux astrocytes, nous avons confirmé que le MMS d'un groupe spécifique d'astrocytes du tronc cérébral évoquait les réponses cardiovasculaires attendues chez les rats, fournissant ainsi preuve de concept.
2.1 Seuil mécanosensoriel des astrocytes en culture
Afin de guider la sélection des particules magnétiques et la conception de dispositifs magnétiques pour les applications in vivo, nous avons d'abord déterminé le stimulus mécanique minimum requis pour déclencher les réponses de signalisation Ca2+ et ATP des astrocytes en culture.
Nous avons conçu un électroaimant « joug » compatible avec un microscope optique conventionnel et capable d'appliquer un stimulus mécanique précis à plusieurs cellules par le biais de particules magnétiques (Figure 1a, b). Avec ce dispositif d'actionnement et des particules de magnétite recouvertes de collagène (Fe3O4), nous avons déterminé que la contrainte mécanique minimale requise pour induire une réponse [Ca2+]i dans les astrocytes était de 0,32 Pa (Figure 1g). Trois ensembles de données ont été obtenus pour permettre cette estimation. Tout d'abord, nous avons augmenté la force appliquée aux astrocytes ornés de particules en augmentant le courant fourni à l'aimant et avons déterminé que le courant d'entrée minimum requis pour déclencher un signal Ca2+ dans les cellules individuelles était compris entre 0,4 et 0,9 A (Figure 1c), correspondant à une densité de flux magnétique médiane entre 0,033 et 0,071 T. Deuxièmement, nous avons calculé la force exercée sur une unité de volume de particules de Fe3O4 pour chaque courant d'entrée utilisé (par exemple, 0,31–0,52 pN µm−3 dans la région centrale de la culture pour 0,6 A, figure 1e), en tenant compte à la fois du champ magnétique généré par l'appareil (figure S2a, informations complémentaires) et de la courbe d'aimantation des particules (figure 1d). Enfin, étant donné que les amas de Fe3O4 attachés aux astrocytes étaient de forme irrégulière et de taille variable (Figure 1c, panneau de gauche), nous avons estimé leurs volumes individuellement comme suit. Nous avons effectué une microscopie électronique à balayage (SEM) et une reconstruction de surface stéréoscopique sur plusieurs cultures et établi qu'il existait une relation de loi de puissance bien définie entre les aires de base et les volumes des amas de Fe3O4 (Figure 1f). En utilisant cette relation, nous avons pu estimer indirectement les volumes des amas de Fe3O4 observés dans les micrographies à fond clair (Figure 1c, panneau de gauche), puisque leurs aires de base étaient connues. En combinant le courant d'entrée minimum requis pour déclencher une réponse dans une cellule donnée, la force calculée appliquée à un volume unitaire de particules de Fe3O4 à ce courant d'entrée et le volume de l'amas de Fe3O4 attaché à cette cellule, nous pourrions calculer le seuil de force pour induisant un signal Ca2+ dans cette cellule. Nous avons déterminé les forces de seuil pour 290 astrocytes, qui ont une médiane de 40,06 pN (Figure S2f, Informations complémentaires). À partir de ces forces de seuil, nous avons dérivé des contraintes de seuil, un déterminant plus pertinent de la déformation de la membrane cellulaire. Les valeurs de contrainte de seuil ont une médiane de 0,32 Pa et présentent une distribution log-normale (Figure 1g).
Seuil de sensibilité astrogliale aux stimuli mécaniques. a) Conception de l'aimant de culasse. Diamètre de la lamelle = 12 mm. Blow-up : la forme des pièces polaires est telle que (B · ∇)B, qui prédit la force exercée sur des particules magnétiques de même type et de même taille, est très uniforme dans une large région de l'espace interpolaire (rouge cercle). b) Vue de face du montage expérimental. c) Un exemple de champ de vision (FOV) montrant des astrocytes avec des particules de Fe3O4 recouvertes de collagène (à gauche) et les traces ratiométriques de fluorescence Fura-2 qui en sont dérivées (au milieu). Les traces et les régions d'intérêt (ROI) sont codées par couleur en fonction des courants d'entrée minimum requis pour déclencher les signaux Ca2+ dans les cellules correspondantes. Les courants de seuil obtenus à partir de 290 cellules sont résumés dans le panneau de droite. d) Courbe d'aimantation des particules de Fe3O4. e) Simulation de la force exercée sur une unité de volume de particules de Fe3O4 à différents courants d'entrée. En haut : exemples de cartes ; cercle rouge = lieu de culture cellulaire ; ellipse en pointillés blancs = région de haute uniformité à laquelle l'imagerie Ca2+ était limitée. En bas : statistiques récapitulatives ; n = 441 points pour chaque condition « dans le cercle » ; n = 184 points pour chaque condition « dans l'ellipse » ; barre, médiane ; boîte, quartiles ; moustaches, gamme. f) Des images SEM de cultures d'astrocytes prises à différents angles d'inclinaison de la scène (en haut à gauche et en haut au milieu) ont été utilisées pour la reconstruction de surface 3D stéréoscopique (en haut à droite) et le calcul du volume et de la surface de base des grappes de Fe3O4 (n = 401, en bas ), qui ont une relation bien définie. g) Les contraintes de seuil pour déclencher les signaux de Ca2+ dans les astrocytes individuels (n = 290) ont été calculées à partir des panneaux c, e et f et elles présentent une distribution log-normale. h) Modifications de la concentration d'ATP extracellulaire ([ATP]e) suite au MMS. La coordonnée horizontale indique la médiane des contraintes subies par l'ensemble de la culture (Figure S2i, Informations complémentaires). n = 8 mesures pour chaque condition. i) Tests répétés des mêmes cultures. n = 16 cultures pour chaque condition. Dans le panneau (c,f) : barre d'échelle = 20 µm. Dans le panneau (h,i) : données affichées sous forme de moyenne ± écart type (S.D.) ; *, p < 0,05, test t bilatéral de la variation moyenne de [ATP]e égale à zéro ; **, p < 0,01, même test ; ***, p < 0,001, même test.
2.2 MMS sélectif des astrocytes in vitro
Nous avons ensuite exploré la possibilité de stimuler sélectivement les astrocytes à l'aide de particules d'oxyde de fer fonctionnalisées avec l'anticorps monoclonal anti-GLAST, [29] qui se lie à un épitope extracellulaire du transporteur glutamate-aspartate (GLAST) de la protéine membranaire spécifique aux astrocytes (Figure 2a).
Particules avec un potentiel d'actionnement mécanique et une spécificité de liaison adéquats. a) L'anticorps anti-GLAST a marqué les cellules exprimant le marqueur astroglial glial fibrillary acidic protein (GFAP), mais pas celles exprimant le marqueur neuronal microtubule-associated protein 2 (MAP2). b) L'actionnement magnétique des particules BioMag Maxi sur les astrocytes en culture par l'aimant de culasse (7 A, 10 mm au-dessus de la base, densité de flux magnétique médiane = 0,12 T) a induit la libération d'ATP lorsque la concentration de la suspension de particules appliquée aux cellules ([particule] ) était de 0,44 mg mL-1, alors qu'aucun changement [ATP]e n'a été observé lorsque [particule] était de 0,22 mg mL-1 (effet [particule], ###, p < 0,001). Le type de ligand sur les particules (collagène versus anti-GLAST) n'a pas affecté les changements [ATP]e (N.S., non significatif, p = 0,278). Voir le tableau S2 dans les informations complémentaires. c) L'actionnement magnétique (7 A, 2 mm au-dessus de la base, densité de flux magnétique médiane = 0,11 T) de particules BioMag Maxi couplées à l'anti-GLAST ([particule] = 0,66 mg mL−1) sur des astrocytes en culture a déclenché des signaux Ca2+. d,e) Mêmes expériences avec des particules SiMAG. De même, [particule] (###, p < 0,001), mais pas le type de ligand sur les particules (N.S., p = 0,641), a eu un effet significatif sur les changements [ATP]e (tableau S3, informations complémentaires). f) Expériences de contrôle. Ni [particule] (N.S., p = 0,689) ni le régime de stimulation (N.S., p = 0,427) n'ont eu d'effet significatif sur les changements de [ATP]e (tableau S4, informations complémentaires). g) Les particules de SiMAG couplées à l'anti-GLAST ont montré une affinité de liaison plus élevée pour les astrocytes GFAP-positifs par rapport aux neurones MAP2-positifs. Dans le panneau (c,e,g) : barre d'échelle = 20 µm. Dans le panneau (b,d,f) : données affichées sous forme de moyenne ± S.D. ; n = 24 mesures pour chaque condition ; **, p < 0,01, test t bilatéral de la variation moyenne de [ATP]e égale à zéro ; ***, p < 0,001, même test.
Étant donné que les grosses particules BioMag Maxi ne seraient pas pratiques pour les applications in vivo, nous avons ensuite étudié la faisabilité d'utiliser les particules SiMAG plus petites (500 nm). Le MMS avec l'aimant de culasse a induit la libération d'ATP à partir de cultures d'astrocytes qui avaient été incubées avec des particules de SiMAG à une concentration de 0,88 mg mL-1 (p = 0,0062) ou de 0,66 mg mL-1 (p = 0,0054), mais pas de 0,44 mg mL −1 (p = 0,091) (Figure 2d). De plus, la concentration de particules a eu un fort effet positif sur la quantité d'ATP libérée (p = 0,00089), tandis que le type de ligand (collagène versus anti-GLAST) sur les particules n'a pas affecté les résultats (p = 0,64) (Figure 2d) . Nous avons également enregistré des signaux de Ca2+ induits par le MMS dans les astrocytes après l'application de particules SiMAG couplées à l'anti-GLAST à 0,88 mg mL-1 (Figure 2e). En revanche, aucune libération d'ATP astrogliale n'a été observée dans quatre expériences de contrôle (Figure 2f) : i) aucune particule n'a été utilisée et aucun champ magnétique n'a été appliqué ; ii) aucune particule n'a été utilisée mais un champ magnétique a été appliqué, suggérant que les astrocytes n'étaient pas affectés par le champ magnétique lui-même ; iii) des particules de SiMAG couplées à l'anti-GLAST ont été attachées aux cellules, mais aucun champ magnétique n'a été appliqué ; et iv) des particules SiMAG non modifiées ont été attachées aux cellules et un champ magnétique a été appliqué. Il est important de noter que l'augmentation de la concentration de particules n'a pas affecté les changements [ATP]e enregistrés dans ces expériences de contrôle (p = 0,69, figure 2f), ce qui signifie que la présence de plus de particules sur les cellules, en soi, n'a pas contribué à l'augmentation de la libération d'ATP. vu dans les expériences précédentes. Enfin, l'immunocytochimie de cultures de cellules neurales mixtes a montré que les particules de SiMAG couplées à l'anti-GLAST étaient principalement attachées aux astrocytes (Figure 2g). Pris ensemble, ces résultats démontrent que les réponses de signalisation Ca2+ et ATP pourraient être induites dans des astrocytes cultivés avec un haut degré de spécificité par actionnement magnétomécanique de particules SiMAG fonctionnalisées avec l'anticorps anti-GLAST.
Après évaluation et sélection des particules, nous avons développé deux dispositifs magnétiques qui pourraient appliquer un champ magnétique à travers le cerveau du rongeur in vivo et produire des stimuli mécaniques plus importants que l'aimant de culasse.
Le Magnetic Mangle se composait de quatre aimants annulaires diamétralement magnétisés disposés dans une grille rectangulaire sur une plate-forme (Figure 3a–c). En montant la plate-forme sur un rail, les aimants pouvaient être déplacés entre la position « marche » où ils entoureraient la tête d'un rongeur et la position « arrêt » à environ 0,3 m de l'animal (Figure 3b). Le champ magnétique dans l'espace inter-aimants pourrait être manipulé en modifiant les orientations des pôles des aimants ou en ajustant les distances entre les aimants. Nous avons d'abord comparé 4 façons différentes d'organiser les orientations des aimants (Figure S4a–d, Informations complémentaires) et avons sélectionné celle qui générait la contrainte la plus élevée (Configuration 4 sur la Figure S4a, Informations complémentaires) pour une utilisation dans les expériences ultérieures. Nous avons ensuite établi avec la modélisation que le rapprochement des aimants les uns des autres produirait des contraintes plus élevées (Figure 3f) et vérifié avec des tests in vitro que l'actionnement de particules SiMAG couplées à l'anti-GLAST attachées aux astrocytes avec une grille magnétique plus petite entraînait plus de libération d'ATP. (Figure 3g). En tenant compte des résultats de l'aimant de culasse et du mangle magnétique, il y avait une forte corrélation positive entre la sortie de contrainte estimée et les changements mesurés de [ATP] e (p = 0,00058, figure 3g). Dans les expériences de contrôle où aucune particule ou particules SiMAG non modifiées n'ont été utilisées, aucune libération d'ATP astrogliale n'a été enregistrée en réponse au MMS (Figure 3h) et il y avait une différence significative entre les résultats obtenus à l'aide de particules SiMAG non modifiées et ceux mesurés à l'aide d'un couplage anti-GLAST. Particules SiMAG (p = 0,0053, figure 3i).
Conception et test de dispositifs magnétiques. a) Conception de la mangle magnétique. Les orientations et les positions des aimants sont réglables. b) Schéma de la configuration expérimentale in vivo (à gauche) et photographies du Magnetic Mangle et du lit animal (à droite). c) Cartes montrant le champ magnétique simulé produit par le Magnetic Mangle et la contrainte estimée via les particules SiMAG. Les cercles fermés gris représentent les aimants. Les flèches indigo indiquent les directions d'aimantation. Les cercles ouverts rouges et les lignes indiquent l'emplacement de la culture cellulaire pour les tests in vitro. d) Champ marginal d'un scanner IRM utilisé pour le MMS. e) Le champ magnétique a été mesuré aux positions « OFF » et « ON » (à gauche et au milieu), et la contrainte via les particules SiMAG a été estimée (à droite). f) Statistiques récapitulatives des contraintes estimées via les particules SiMAG dans l'emplacement de la culture cellulaire pour le Magnetic Mangle (n = 441 points pour chaque condition) et dans l'ensemble du cube de mesure pour le scanner IRM (n = 125 points pour chaque condition). Barre, médiane. Encadré, quartiles. Moustaches, gamme. g–i) [ATP]e change après MMS d'astrocytes en culture avec différents dispositifs et préparations SiMAG. Dans le panneau (g, h) : données affichées sous forme de moyenne ± S.D. ; ligne violette dans le panneau (g), régression linéaire (tableau S7, informations complémentaires). Dans le panneau (i) : données affichées sous forme de moyenne ± erreur standard ; l'utilisation de particules SiMAG couplées à l'anti-GLAST a entraîné une plus grande libération d'ATP induite par le MMS que l'utilisation de particules SiMAG non modifiées (tableau S8, informations complémentaires). Dans le panel (g-i) : n = 24 mesures pour chaque condition ; *, p < 0,05, test t bilatéral de la variation moyenne de [ATP]e égale à zéro ; **, p < 0,01, même test.
2.4 Devenir des particules in vivo
Les astrocytes de la moelle ventrolatérale (VLM) sont capables de moduler l'activité des neurones C1 sympathoexcitateurs locaux exprimant la tyrosine hydroxylase (TH) via la signalisation médiée par l'ATP, et de produire des augmentations du lecteur sympathique central, de la pression artérielle (ABP) et de la fréquence cardiaque [30, 31] Pour valider la méthode de MMS in vivo, nous avons cherché à stimuler les astrocytes dans le VLM de rats, tout en surveillant les changements d'ABP comme indicateur de la signalisation astrogliale dans cette région du cerveau. Pour préparer ces expériences, nous avons étudié le sort des particules SiMAG couplées à l'anti-GLAST après leur injection dans le tronc cérébral du rat.
Nous avons utilisé l'IRM pour déterminer l'emplacement du site d'injection, suivi d'une immunohistochimie pour confirmer que les particules se trouvaient à proximité des neurones TH-positifs (Figure 4 ; Figure S5, Informations complémentaires). Un jour après avoir injecté 1 µL d'une suspension avec une concentration de 1 mg mL-1 ou 0,5 mg mL-1, nous avons observé une agrégation visible des particules (Figure S5a,b, Informations complémentaires). La distribution était plus diffuse lorsqu'une suspension de 0,25 mg mL-1 était microinjectée (Figure 4a). Les particules sont restées visibles sur les images IRM au jour postopératoire (POD) 4 et au POD7, mais les signaux de fluorescence des particules sont devenus progressivement plus faibles au POD4 et au POD7 (Figure 4b, c ; Figure S5c, Informations complémentaires), ce qui suggère que certaines particules ont été éliminées. cette fois. Il a été constaté que les particules de SiMAG couplées à l'anti-GLAST colocalisent ou se trouvent à proximité immédiate des astrocytes, qui ont été marqués avec un anticorps contre la protéine acide fibrillaire gliale (GFAP) et un anticorps contre le transporteur d'acides aminés excitateurs 2 (EAAT2) ou GLAST , tandis que les noyaux des neurones, marqués avec un anticorps dirigé contre les noyaux neuronaux (NeuN), étaient pour la plupart à distance des particules (Figure 4 ; Figure S5, Informations complémentaires). La microglie envahissante, marquée avec un anticorps contre le cluster de différenciation 68 (CD68), n'a montré pratiquement aucun chevauchement avec les signaux des particules à POD1, mais à POD4 et POD7, certaines particules ont pu être vues colocaliser avec ces cellules (Figure 4 ; Figure S5, Informations complémentaires).
Devenir des particules de SiMAG couplées à l'anti-GLAST injectées dans le tronc cérébral du rat. Chaque rat a reçu une injection unilatérale de 1 µL d'une suspension de 0,25 mg mL-1 de particules de SiMAG couplées à l'anti-GLAST. Une IRM a été réalisée et les images acquises ont été enregistrées de manière affine les unes par rapport aux autres. Les réticules des images IRM marquent le même emplacement anatomique dans chaque cerveau. Les animaux ont été sacrifiés à différents moments et des sections de tronc cérébral ont été colorées pour les marqueurs microgliaux (CD68), astrogliaux (GFAP, GLAST et EAAT2) et neuronaux (NeuN et TH). Trois coupes consécutives sont présentées pour chaque rat. POD, jour postopératoire. Barre d'échelle = 20 µm. Nombre d'animaux utilisés = 3.
2.5 Stimulation magnétomécanique des astrocytes in vivo
Initialement, le scanner IRM était utilisé comme dispositif d'actionnement magnétique. Un, trois ou quatre jours après une seule injection de 1 µL de particules SiMAG couplées à l'anti-GLAST (0,5 ou 0,25 mg mL-1) dans le VLM, nous avons pu évoquer à plusieurs reprises une forte augmentation de l'ABP en déplaçant la tête de l'animal à la position "on" dans le champ de frange du scanner IRM (Figure 5a, b). Dans les groupes témoins (animaux naïfs et fictifs), de telles élévations d'ABP n'ont pas été observées après l'exposition de la tête à la position "on" (Figure 5c). Par comparaison, les changements de PBA étaient significativement plus importants dans les groupes expérimentaux que dans les groupes témoins (p = 0,000013 pour les groupes POD1 par rapport aux groupes témoins, p = 0,0000096 pour les groupes POD3 et POD4 par rapport aux groupes témoins, figure 5d).
Stimulation magnétomécanique des astrocytes in vivo. a–c) Réponses cardiovasculaires chez des rats anesthésiés induites par le MMS. Le champ magnétique de frange du scanner IRM a été appliqué en déplaçant la tête de l'animal vers le bord de l'alésage du scanner. Les animaux des groupes expérimentaux (a, b) ont reçu des microinjections unilatérales de particules SiMAG couplées à l'anti-GLAST (1 µL, 0,25 ou 0,50 mg mL-1) dans le VLM et des expériences de stimulation ont été réalisées 1, 3 ou 4 jours après la injection. Les groupes témoins (c) étaient composés d'animaux naïfs et d'animaux opérés de manière fictive qui ont reçu des microinjections unilatérales d'une solution d'anticorps anti-GLAST (1 µL, 5 µg mL-1). Lignes du haut et du milieu : données d'un exemple d'animal du groupe. Rangée du bas : moyenne des tracés de la pression artérielle moyenne (MAP) ; barre d'erreur = S.D. ; n = 12 traces pour chaque groupe. d) Statistiques récapitulatives des changements de MAP (ΔMAP, la différence de MAP entre la période de pré-stimulation et la période d'application du champ magnétique, à l'exclusion des 30 premières secondes de mouvement du berceau). n = 6 mesures pour chaque condition (2 mesures par animal). Nombre d'animaux utilisés = 18. ####, p < 0,0001, test t bilatéral à deux échantillons. #####, p < 0,00001, même test. e) Réponses cardiovasculaires induites par le Magnetic Mangle chez un rat qui a reçu des microinjections bilatérales de particules SiMAG couplées à l'anti-GLAST dans le VLM. Pour les expériences de contrôle, les aimants ont été remplacés par des mannequins en plastique de forme identique afin que l'appareil n'applique aucun champ magnétique. Trace blanche, MAP. ABP, tension artérielle. FC, fréquence cardiaque. bpm, battements par minute. f) Statistiques récapitulatives des changements dans MAP et HR. n = 5 mesures pour chaque condition (1 mesure par animal). Nombre d'animaux utilisés = 5. #, p < 0,05, test t bilatéral apparié. Dans le panneau (a–c,e) : ligne pointillée magenta, niveau moyen avant la stimulation. Dans le panneau (d,f) : données affichées sous forme de moyenne ± S.D.
Pris ensemble, ces résultats ont démontré que le contrôle in vivo de la signalisation astrogliale dans une zone discrète du cerveau peut être réalisé avec le MMS à distance.
Dans cette étude, nous avons exploité la mécanosensibilité des astrocytes pour développer une nouvelle technologie permettant d'activer à distance des événements clés de signalisation astrogliale. Nous avons établi le seuil mécanosensoriel des astrocytes, évalué différents types de particules d'oxyde de fer et de dispositifs magnétiques, caractérisé le devenir in vivo des particules magnétiques sélectionnées et démontré l'efficacité du MMS pour le contrôle à distance des astrocytes dans le cerveau vivant.
Afin d'évaluer l'ampleur des stimuli mécaniques qui doivent être produits, nous avons d'abord étudié le seuil mécanosensoriel des astrocytes et constaté que le stress minimum requis pour déclencher la signalisation astrogliale Ca2+ et ATP était de 0,32 Pa. Plusieurs études dans lesquelles des cultures cellulaires ont été soumises aux contraintes de cisaillement générées par l'écoulement de fluide ont rapporté des seuils similaires pour déclencher des signaux de Ca2+ (0,20 Pa,[32] 0,23 Pa[33] et 1,53 Pa[34]). Le seuil plus élevé de 1,53 Pa rapporté sur les astrocytes [34] pourrait être dû au fait que l'écoulement de fluide applique une contrainte de cisaillement sur toute la surface apicale de la cellule cultivée, alors que la contrainte générée via les particules magnétiques est beaucoup plus localisée. De plus, les signaux de Ca2+ stimulés mécaniquement dans les astrocytes dépendent largement des actions autocrines de l'ATP libéré. [28, 35] Par conséquent, lorsque le flux de liquide est utilisé comme stimulus, une partie de l'ATP libéré peut avoir été rapidement emportée, ce qui entraîne des réponses plus faibles. et une surestimation du seuil.
Ensuite, nous avons montré que les particules submicrométriques de SiMAG, lorsqu'elles étaient fonctionnalisées avec l'anticorps anti-GLAST, se liaient sélectivement aux astrocytes et permettaient un MMS efficace. De manière notable, les particules couplées à l'anti-GLAST ont aussi bien fonctionné que celles recouvertes de collagène, ce qui suggère que l'identité moléculaire de la cible des particules n'est pas importante et que le MMS est une méthode généralisable. Récemment, il a été montré que la fixation de particules magnétiques sur des neurones en culture permettait leur activation par un champ magnétique [36, 37] Par conséquent, avec une stratégie de ciblage adaptée, il est possible de réaliser une manipulation sélective in vivo des neurones avec le MMS.
Pour démontrer la faisabilité de la stimulation magnétomécanique des astrocytes in vivo, nous avons utilisé soit le champ marginal d'un scanner IRM, soit un appareil sur mesure.[38] Ce dernier, nommé Magnetic Mangle, est un appareil simple, peu coûteux à fabriquer et capable de produire les forces requises chez les petits animaux. Avec le champ de frange du scanner IRM, les limitations sur la taille des sujets sont atténuées et la portée de l'étude peut être élargie pour inclure des expériences comportementales. Par exemple, le champ marginal d'un scanner IRM a été utilisé pour faire naviguer les instruments dans le système vasculaire du porc [39] et moduler le comportement alimentaire chez les souris en mouvement libre [17]. En outre, les gradients programmables à l'intérieur de l'alésage du scanner IRM ont été utilisés pour orienter les agents thérapeutiques magnétiques afin d'améliorer l'administration [40-42] et pourraient être utilisés en tandem avec le MMS.
La technologie MMS se prête bien à la traduction clinique en raison de plusieurs avantages distincts. Premièrement, l'obviation de la modification génétique surmonte un obstacle majeur au développement de l'optogénétique et de la chimiogénétique en tant que thérapies. ceux posés par la protéine étrangère elle-même. Par exemple, l'activation de ChR2 permet l'afflux de protons, ce qui, dans le cas des astrocytes, est hautement indésirable car l'acidose gliale peut entraîner une excitotoxicité neuronale.[43] Avec le MMS, ces risques sont inexistants. Deuxièmement, il peut ne nécessiter qu'un développement minimal pour tirer parti des scanners IRM existants dans les hôpitaux en tant qu'imageur pour évaluer de manière non invasive la livraison de particules et le dispositif d'actionnement pour effectuer le MMS. Enfin, la sécurité des nanoparticules d'oxyde de fer (IONP) a fait l'objet d'études approfondies, tant précliniques que cliniques, depuis plus de 20 ans.[44] Des études ont montré que les IONP ont un degré élevé de biocompatibilité dans le cerveau [45] et sont bien tolérés par les astrocytes et les neurones. [46-48] En particulier, les astrocytes n'ont présenté aucun changement substantiel dans la viabilité et le métabolisme du glucose et du glutathion jusqu'à une semaine. après exposition aux IONP.[49] Dans le cerveau vivant, les IONP injectés directement étaient toujours présents après 3 mois et l'évaluation histologique n'a révélé aucune modification pathologique des cellules cérébrales ou de la myéline.[50] De plus, les essais cliniques d'hyperthermie magnétique, qui impliquaient l'injection intracrânienne de grandes quantités d'IONP, n'ont signalé aucun effet secondaire grave dû aux particules. [51-53] La clairance des particules magnétiques dans le cerveau peut impliquer la microglie, car nous avons noté une certaine internalisation. des particules par les cellules CD68-positives. Il existe également des preuves que les ganglions lymphatiques cervicaux sont une voie de clairance possible pour les IONP délivrés au parenchyme cérébral.[54] Bien que des études antérieures indiquent un profil d'innocuité robuste, il convient de noter que l'absorption, la stabilité et la clairance, donc.En comparaison avec les méthodes de neuromodulation existantes, le MMS présente plusieurs défis. Une caractéristique puissante de l'optogénétique est qu'elle permet un contrôle rapide et précis des neurones.[55] Il reste à voir si la même chose peut être obtenue avec le MMS, car cela n'a pas été exploré dans des études où des forces magnétiques ont été appliquées à des neurones en culture. [36, 37] Cependant, dans cette étude, le MMS a permis un contrôle plus rapide des astrocytes que l'optogénétique, car le déclenchement des signaux Ca2+ avec le MMS se faisait sur une échelle de temps inférieure à la seconde (Figure 1c), tandis que le temps de montée était de l'ordre de plusieurs secondes avec l'optogénétique.[10] De plus, l'élévation de l'ABP suite à la stimulation des astrocytes VLM s'est également produite plus rapidement avec le MMS (Figure 5) qu'avec l'optogénétique.[30] Un autre problème avec le MMS est que, dans sa forme actuelle, l'injection intracrânienne invasive est toujours nécessaire. Plusieurs stratégies ont été explorées pour permettre aux IONP administrés par voie systémique de traverser la barrière hémato-encéphalique,[56] y compris les ultrasons focalisés[57] et l'hyperthermie magnétique.[58] Par conséquent, il pourrait être possible d'éliminer l'injection intracrânienne et de rendre le MMS peu invasif. Enfin, dans la mise en œuvre actuelle du MMS, des concentrations relativement élevées de particules magnétiques ont été employées. De manière encourageante, il a été démontré qu'après l'exposition d'astrocytes en culture à une dispersion concentrée d'IONP contenant 4 mM de fer (environ 2,5 mM de fer dans 0,25 mg mL-1 SiMAG dans cette étude), la viabilité cellulaire et le métabolisme du glucose et du glutathion n'étaient pas compromis et la production d'espèces réactives de l'oxygène n'a augmenté que de manière transitoire sur une période de sept jours.[49] Il existe également des stratégies pour réduire la concentration de particules nécessaire pour un MMS efficace. L'aimantation à saturation des particules SiMAG, qui contiennent des noyaux de maghémite, n'est que d'environ 22 % de celle des particules BioMag contenant de la magnétite (Figure S3b, Informations complémentaires). En passant à des particules contenant de la magnétite, une force plus importante peut être produite via des particules de même taille, ainsi une quantité réduite de particules devrait être attachée aux cellules. De plus, une fois que de petits IONP (15 nm) sont attachés de manière clairsemée à la membrane cellulaire, il est possible de les agréger en grands (> 200 nm) en exposant les cellules à un champ magnétique statique (0,15 T, 1 heure).[ 59] Cela peut permettre de réduire davantage la concentration en particules.
En conclusion, nous rapportons ici le développement et la validation d'une nouvelle méthode d'activation à distance des réponses de signalisation Ca2+ et ATP dans les astrocytes, ajoutant à l'arsenal des technologies de contrôle cellulaire qui aideront à faire progresser notre compréhension de la fonction cérébrale et à combattre les troubles du SNC.
Soin et utilisation des animaux
Des cultures cellulaires ont été préparées à partir du tissu cérébral de ratons mâles et femelles Sprague-Dawley (2 à 5 jours après la naissance). Des expériences in vivo ont été réalisées sur de jeunes rats Sprague-Dawley mâles adultes (80 à 120 g ou 270 à 310 g). Les rats ont été logés en groupe et maintenus sur un cycle lumineux de 12 h (lumières allumées à 07h00) et avaient un accès ad libitum à l'eau et à la nourriture. Toutes les procédures animales ont été approuvées par le UK Home Office (Project License No. PECE77103) et l'Animal Welfare and Ethical Review Body de l'University College London. Les directives ARRIVE 2.0 sont suivies lors de la déclaration des expériences in vivo. L'estimation de la taille de l'échantillon et les critères d'inclusion et d'exclusion sont décrits dans la section « Analyse statistique ». Aucune randomisation ou mise en aveugle n'a été effectuée.
Culture de cellules
Des cultures primaires d'astrocytes corticaux ont été préparées comme décrit en détail précédemment. [60, 61] Après dissection et dissociation du tissu cortical, les cellules ont été étalées sur des flacons de culture T75 (Thermo Fisher Scientific) recouverts de poly-D-lysine (Merck Millipore ). Les cultures ont été maintenues dans un milieu contenant du milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM) avec un supplément de glucose élevé et de GlutaMAX, 10 % de sérum bovin fœtal (FBS), 100 U mL-1 de pénicilline et 100 µg mL-1 de streptomycine (tous de Gibco) à 37 ans. °C dans une atmosphère humidifiée à 5 % de CO2 et 95 % d'air. Après 7 à 8 jours, les flacons de culture ont été secoués sur un agitateur orbital à 180 tr/min pendant 5 à 6 h pour éliminer les cellules précurseurs de la microglie et des oligodendrocytes. Les cellules restantes ont été replaquées sur des lamelles circulaires de 12 mm (Gerhard Menzel GmbH) recouvertes de poly-D-lysine. Le revêtement a été réalisé en immergeant chaque lamelle dans une solution de poly-D-lysine (300 µL, 25 µg mL-1) pendant 1 h. Environ 75 000 cellules ont été étalées sur une lamelle couvre-objet. Les cellules ont été utilisées entre 10 et 21 jours in vitro. Les cultures de cellules d'astrocytes ainsi obtenues ont une grande pureté (figure S1, informations complémentaires).
Des cultures mixtes de cellules neurales ont été préparées comme décrit en détail précédemment.[62] Après dissection et dissociation du tissu cortical, les cellules ont été étalées sur des lamelles de 12 mm recouvertes de poly-D-lysine et maintenues dans un milieu contenant du Neurobasal-A, 2 % de supplément B-27, 1 % de supplément GlutaMAX, 100 U mL− 1 pénicilline et 100 µg mL-1 de streptomycine (tous de Gibco) à 37 °C dans une atmosphère humidifiée à 5 % de CO2 et à 95 % d'air. Les cellules ont été utilisées entre 7 et 14 jours in vitro.
Particules d'oxyde de fer
Cinq types de particules d'oxyde de fer ont été utilisés dans cette étude (tableau S1, informations complémentaires). Les images des particules ont été acquises avec SEM et microscopie optique (Figure S3a, Informations complémentaires). Un dispositif d'interférence quantique supraconducteur (SQUID) a été utilisé pour mesurer le moment magnétique (m) des particules à une série d'intensités de champ magnétique (H). La masse des particules a été divisée par leur densité pour donner le volume (V), et m a été divisé par V pour donner la magnétisation des particules (M). Pour les particules Fe3O4 (Figure 1d), les mesures M-H ont été modélisées par une courbe sigmoïde en résolvant les paramètres de la fonction
(1)
en utilisant la fonction d'ajustement du modèle de régression non linéaire "fitnlm" dans MatLab (MathWorks). Pour les autres types de particules (Figure S3b, Informations complémentaires), les mesures M-H ont été modélisées par une courbe spline cubique à l'aide de la fonction "spline" dans MatLab.
Les particules d'oxyde de fer ont été fonctionnalisées avec du collagène ou de l'anti-GLAST. Le collagène a été utilisé pour favoriser la liaison des particules magnétiques à la membrane cellulaire, quel que soit le type de cellule. Anti-GLAST est un anticorps monoclonal qui se lie spécifiquement à un épitope extracellulaire de la protéine transmembranaire GLAST qui est exprimée par les astrocytes, la glie de Bergmann, la glie de Müller et la glie radiale, mais pas par les neurones, les oligodendrocytes, la microglie ou les progéniteurs neuronaux.[29]
Les particules de Fe3O4, qui étaient sous forme de poudre sèche, ont été recouvertes de collagène selon une procédure décrite précédemment.[63] Tout d'abord, les particules de Fe3O4 (20 mg) ont été incubées avec un mélange de solution de collagène de type I (50 µL, 3,0 mg mL-1, Sigma-Aldrich), de solution saline tamponnée au phosphate (PBS, 200 µL) et de solution de NaOH (5 µL, 1 M) à 37 oC pendant 1 h (masse de ligand (µg)/masse de particules (mg) = 7,5). Ensuite, les particules ont été lavées trois fois avec du PBS, remises en suspension dans du PBS (500 µL) et stockées à 4 °C.
Toutes les autres particules consistaient en un ou plusieurs noyaux d'oxyde de fer incorporés dans une matrice et portaient des groupes carboxyle de surface, permettant le couplage du ligand par une réaction chimique. Les groupes carboxyle, lorsqu'ils sont activés par le 1-éthyl-3-(3-diméthylaminopropyl) carbodiimide (EDAC), peuvent réagir avec les groupes amino dans les protéines pour former des liaisons amide covalentes.
Le couplage de ligand pour les particules BioMag Plus a été effectué conformément aux instructions du fabricant. Les particules (1 mg) ont été lavées quatre fois avec un tampon d'acide 2-(N-morpholino)éthanesulfonique (MES, Sigma-Aldrich) (50 mM, pH 5,2), suivi d'une activation dans le tampon MES (120 µL) contenant 13,33 mg mL−1 EDAC (VWR International) pendant 30 min à température ambiante dans un rotateur. Ensuite, les particules ont été lavées quatre fois avec le tampon MES, remises en suspension dans un mélange d'une solution anti-GLAST (50 µL, 0,10 mg mL-1, Miltenyi Biotec) et le tampon MES (10 µL), et incubées pendant 16 h à température ambiante dans un rotateur (masse de ligand (µg)/masse de particules (mg) = 5,0). Après cela, les particules ont été lavées deux fois avec le tampon MES et incubées dans une solution de glycine (1 M, pH 8,0) pendant 30 min à température ambiante dans un rotateur. Enfin, les particules ont été lavées quatre fois avec une solution de stockage contenant du tris(hydroxyméthyl)aminométhane (Tris, 0,01 M), du NaCl (0,15 M), de l'albumine de sérum bovin (BSA, 1 mg mL−1), de l'acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA, 0,001 M) et de l'azoture de sodium (1 mg mL−1), avant d'être remis en suspension dans la solution de stockage (100 µL) et stocké à 4 °C.
Les protocoles de préparation des particules BioMag Maxi et SiMAG couplées à l'anti-GLAST ont été optimisés pour améliorer l'efficacité du couplage du ligand (figures S6 et S7, informations complémentaires, respectivement). La version finalisée pour la préparation des particules BioMag Maxi est la suivante. Tout d'abord, les particules (1 mg) ont été lavées quatre fois avec un tampon de couplage (pH 5,5) contenant du NaCl (0,15 M) et du K2HPO4 (0,01 M), suivi d'une activation dans le tampon de couplage (120 µL) contenant 33,33 mg mL-1 EDAC pendant 10 min à température ambiante dans un rotateur. Ensuite, les particules ont été lavées deux fois avec le tampon de couplage, remises en suspension dans un mélange de la solution anti-GLAST (50 µL) et du tampon de couplage (10 µL), et incubées pendant 1 h à température ambiante dans un rotateur (massligand (µg )/masse de particules (mg) = 5,0). Enfin, les particules ont été lavées quatre fois avec du PBS, remises en suspension dans du PBS (100 µL) et stockées à 4 °C. Le protocole pour les particules SiMAG était similaire, sauf que le tampon de couplage était un tampon MES (100 mM, pH 5,0), la concentration de la solution EDAC pour l'activation des particules était de 4,17 mg mL-1 et les particules activées étaient incubées avec l'anti- Solution GLAST pendant 2 h.
Pour recouvrir les particules BioMag Plus, BioMag Maxi ou SiMAG de collagène, les particules (1 mg) ont d'abord été lavées deux fois avec le tampon de lavage approprié. Ensuite, les particules ont été remises en suspension dans un mélange de solution de collagène (16,7 µL) et de tampon de lavage (103,3 µL), et incubées pendant 1 à 2 h à température ambiante dans un rotateur (masse de ligand (µg)/masse de particules (mg) = 50,0 ). Enfin, les particules ont été lavées trois fois avec du PBS, remises en suspension dans du PBS (100 µL) et stockées à 4 °C.
Efficacité de couplage de ligand
L'efficacité de couplage du ligand a été déterminée en mesurant la quantité de ligand restant dans la solution après le processus de couplage.
La concentration de collagène a été quantifiée à l'aide du dosage des protéines de Bradford. Le réactif Coomassie (Bradford) Protein Assay (Thermo Scientific) a été modifié pour contenir 0,035 mg mL-1 de sulfate de docécyle de sodium (SDS)[64] afin d'augmenter la pente de la courbe standard de collagène et d'aider à résoudre les petites différences. Tout d'abord, la solution de test (5 µL) a été ajoutée au réactif de dosage (250 µL), et le mélange a été vortexé et laissé à température ambiante pendant 10 min. Ensuite, le mélange a de nouveau été vortexé, avant qu'une partie (100 µL) ne soit prélevée et ajoutée à une plaque à 96 puits. Enfin, l'absorbance a été mesurée à 570 nm à l'aide d'un lecteur de microplaques (Multiskan FC, Thermo Scientific).
L'anticorps anti-GLAST
(3)
En approximation, les variations par rapport à x sont ignorées et la condition est simplifiée en
(4)
Cela donne
(5)
où a et b sont des constantes. Toujours selon Garber et ses collègues, [66] Bx dans l'écart est supposé être inversement proportionnel à la largeur de l'écart
(6)
avec Δx étant la moitié de la largeur de l'intervalle au niveau y. Il s'ensuit que
(sept)
où c est une autre constante. Cette formule détermine la forme de surface des têtes de pôles pour des valeurs positives de y. Pour des valeurs négatives de y la géométrie des têtes de poteaux est donnée par
(8)
où dmin est la moitié de la séparation minimale des pôles (à y = 0), c'est-à-dire
(9)
En tant qu'équilibre entre la maximisation de Bx et l'autorisation d'un écartement des pôles suffisamment grand, les valeurs finalement choisies pour les constantes définissant la forme des pôles en mm étaient : a = −0,1, b = 4 et c = 100.
Cette conception a été soumise à une analyse par éléments finis à l'aide du logiciel de simulation Vector Fields Opera-3D v12 (Cobham Technical Services), et la simulation a montré que, dans une grande partie de l'écartement des pôles, l'amplitude et la direction de (B · ∇)B , qui est un bon corrélat de la force exercée sur les particules magnétiques, serait hautement uniforme. Pour fabriquer l'aimant, un alliage SiFe doux (fer à noyau de silicium "B-FM", Carpenter Technology Corporation) a été façonné dans les pièces polaires, qui ont été reliées entre elles par un cylindre en alliage SiFe (20 mm de diamètre), puis un cuivre fil a été enroulé autour du cylindre pour produire la bobine de solénoïde (1035 tours en 10 couches). Pour permettre l'imagerie des cellules vivantes, une chambre de culture pouvant contenir une lamelle couvre-objet de 12 mm à une position définie par rapport aux pièces polaires a été réalisée à l'aide d'une imprimante 3D à frittage laser en plastique Formiga P100 (EOS GmbH). Pour vérifier la caractéristique de conception de l'aimant de culasse, un mètre GM08 Gauss (Hirst Magnetic Instruments) a été utilisé pour mesurer la densité de flux magnétique en une série de points le long de la ligne médiane entre les pièces polaires à 10 mm ou 2 mm au-dessus de la base de l'aimant sur une gamme d'amplitudes de courant d'entrée. Une correspondance étroite entre les valeurs simulées et mesurées a été trouvée (Figure S2b, Informations complémentaires), validant ainsi les simulations (Figure S2a, Informations complémentaires). Lorsque la culture cellulaire est placée à 10 mm au-dessus de la base de l'aimant, à savoir au milieu de la hauteur de l'aimant, les forces exercées sur les particules magnétiques sont entièrement horizontales et parallèles au plan d'imagerie, mais à 2 mm au-dessus de la base de l'aimant, les forces avoir des composantes verticales appréciables (Figure S2e, Informations complémentaires).Pour effectuer une stimulation magnétomécanique des astrocytes in vivo, un dispositif appelé "Magnetic Mangle" a été fabriqué sur la base de la conception proposée par Cugat et ses collègues.[38] Il se composait de quatre aimants permanents NdFeB de qualité N42 magnétiques diamétralement en forme d'anneau (diamètre extérieur = 20 mm, diamètre intérieur = 6 mm, hauteur = 20 mm, Magnet Expert Ltd) disposés sur une plate-forme dans une grille rectangulaire. Le champ magnétique dans l'espace inter-aimants pourrait être radicalement modifié en modifiant les directions vers lesquelles pointaient les pôles des aimants. Les distances entre les aimants eux-mêmes pourraient également être ajustées. La plate-forme était montée sur une piste, de sorte que le champ magnétique pouvait être appliqué ou interrompu en déplaçant les aimants vers ou à partir de l'emplacement cible. Semblable à l'aimant de culasse, la direction de la force produite sur les particules magnétiques par le Magnetic Mangle était largement parallèle au plan xy tel que défini à la figure 3c. Le champ magnétique dans l'espace inter-aimant a été modélisé à l'aide du logiciel de simulation Opera et les valeurs ont été vérifiées en les comparant aux mesures obtenues à l'aide du compteur de Gauss.
Enfin, un système d'imagerie par résonance magnétique à forage horizontal VNMRS de 9,4 T (Agilent Technologies) a été utilisé comme dispositif d'actionnement magnétique. Le bord du forage de l'aimant et une position à 0,66 m du bord ont été choisis respectivement comme emplacements « activé » et « désactivé ». À chaque emplacement, le champ magnétique a été mesuré à 125 points d'un réseau cubique, dont le bord mesurait 20 mm de long et contenait 5 points régulièrement espacés.
Calcul de la force et de la contrainte
La force magnétique sur un dipôle magnétique ponctuel m dans un champ de densité de flux magnétique B est définie comme [67, 68]
(dix)
Dans le cas d'une particule magnétique en suspension dans un milieu faiblement diamagnétique tel que l'eau, le moment magnétique total sur la particule peut être exprimé comme
(11)
où V est le volume de la particule et M est son aimantation volumétrique. Par conséquent
(12)
Cela peut être étendu à
(13)Les champs B des aimants sur mesure ont été estimés par analyse par éléments finis et vérifiés par des mesures. Le champ B du scanner IRM a été mesuré. L'aimantation M d'un type particulier de particules lors de l'exposition à une intensité de champ magnétique donnée H a été obtenue à partir de la courbe adaptée aux mesures M-H pertinentes. H est lié à B par l'équation suivante
(14)
où μr est la perméabilité relative du milieu. La valeur de μr pour l'air (1,000000,37) ou l'eau (0,999990,93) est très proche de 1. Par conséquent, pour un champ B donné, le champ H correspondant et, à son tour, l'aimantation M des particules pourraient être calculés .
Avec toutes ces quantités connues, la force par unité de volume a été estimée pour un type particulier de particules actionnées par un aimant particulier. À mi-hauteur de l'aimant de culasse (10 mm au-dessus de la base), la force exercée sur les particules de même type et de même taille à l'intérieur de l'emplacement de la culture cellulaire était très uniforme (Figure S2e, Informations complémentaires). Cependant, comme l'espace polaire était trop étroit pour qu'une lentille de microscope typique puisse imager le plan à 10 mm au-dessus de la base, la culture cellulaire a été placée à 2 mm au-dessus de la base pour les expériences d'imagerie calcique. À cette hauteur, la force était plus variable selon l'emplacement, mais l'inhomogénéité était beaucoup moins grave autour de la ligne médiane (dans l'ellipse blanche de la figure S2e dans les informations complémentaires), par conséquent, l'imagerie calcique était limitée à cette région. Une fois que le courant d'entrée minimum requis pour déclencher un signal Ca2+ dans un astrocyte a été déterminé, la force appliquée a été considérée comme la médiane des valeurs de force par unité de volume estimées pour ce courant d'entrée et délimitée par l'ellipse centrale.
Pour estimer le volume des particules, les particules SiMAG et fluidMAG ont été supposées être des sphères monodisperses avec des diamètres égaux aux tailles nominales données par les fabricants (tableau S1, informations complémentaires), tandis que les particules BioMag Plus ont été supposées être des disques d'un diamètre de 1,5 µm et une hauteur de 0,2 µm. Étant donné que la forme et la taille des amas de particules de Fe3O4 recouvertes de collagène étaient très irrégulières, leurs volumes ont été estimés individuellement comme suit. Tout d'abord, la concentration et le volume de travail de la suspension de Fe3O4 pour incuber les cultures cellulaires ont été établis à 0,22 mg mL-1 et 353 µL, respectivement, dans un puits d'une plaque à 24 puits. Cela a produit une distribution clairsemée de grappes de particules, et les cellules étaient principalement associées à des grappes uniques et distinctes. Ensuite, dans des micrographies à fond clair, les amas de Fe3O4 attachés aux cellules ont été localisés et leurs aires de base calculées à l'aide d'ImageJ. Enfin, pour pouvoir estimer le volume d'un cluster Fe3O4 à partir de sa surface de base, la relation entre les deux a été examinée à l'aide de SEM. Trois cultures d'astrocytes ornées de particules de Fe3O4 ont été imagées (voir ci-dessous pour le protocole SEM). Pour chaque champ de vision (FOV), deux images ont été prises à 10° et 20° d'inclinaison de la scène respectivement. À l'aide de MountainsMap SEM (Digital Surf sarl), une reconstruction de surface 3D stéréoscopique a été effectuée sur chaque paire d'images, suivie d'une correction d'inclinaison, produisant une carte topographique. Ensuite, les régions d'intérêt (ROI) ont été dessinées et la surface de base et le volume de chaque cluster Fe3O4 ont été calculés. À partir de ces données, la relation entre la surface de base et le volume a été déduite et utilisée pour estimer le volume des amas de Fe3O4 associés aux cellules.Après avoir déterminé la force exercée sur une particule magnétique, la contrainte qu'elle produirait au point de contact avec une cellule a été calculée. La contrainte était égale à la force agissant sur la surface de la section transversale d'un objet divisée par la surface de la section transversale. Pour les particules SiMAG et fluidMAG, la zone a été supposée être la zone de la section transversale passant par le centre de la sphère. Pour les particules BioMag Plus, la surface a été supposée être la surface de la face du disque. Pour les particules de Fe3O4, les aires de base des amas ont été utilisées.
Imagerie calcique
Les cultures cellulaires ont été lavées deux fois avec une solution saline équilibrée de Hanks (HBSS) avant d'être incubées dans du HBSS contenant des particules d'oxyde de fer pendant 0,5 à 1 h à température ambiante. Ensuite, les cellules ont été lavées deux fois avec du HBSS et incubées dans du HBSS contenant du Fura-2 AM (4 µM, Invitrogen) et du Pluronic F-127 (0,04 %, Invitrogen) pendant 0,5 à 1 h à température ambiante dans l'obscurité, suivi de deux autres lave avec HBSS. Les changements dans le [Ca2+]i des cellules individuelles au cours des expériences MMS ont été surveillés à l'aide d'un microscope inversé Olympus IX71 avec une caméra Andor CCD. La lumière d'excitation a été fournie par une lampe à arc au xénon, le faisceau traversant un monochromateur à 340 et 380 nm (Cairn Research) et la fluorescence émise à 515 nm a été enregistrée.
Pour estimer le seuil mécanosensoriel des astrocytes, les enregistrements des expériences utilisant l'aimant de culasse et les particules de Fe3O4 recouvertes de collagène ont été analysés comme suit. Le rapport entre la fluorescence de Fura-2 excitée à 340 nm et celle à 380 nm, qui donne une indication précise des changements de [Ca2+]i, a d'abord été calculé. Une cellule était considérée comme réactive si la valeur maximale atteinte par le signal ratiométrique Fura-2 pendant les 20 s suivant le début du stimulus était supérieure à la ligne de base (calculée comme la moyenne sur les 20 s avant la stimulation) de plus de 25 % .[69] Les cellules ont été soumises à une série de stimuli magnétomécaniques d'amplitudes croissantes, et pour une cellule donnée, le premier stimulus déclenchant une réponse était considéré comme le seuil. La distribution des valeurs seuils obtenues à partir des différentes cellules a été modélisée par une courbe log-normale en résolvant pour les paramètres A, μ et σ de la fonction
(15)
en utilisant la fonction "fitnlm" dans MatLab.
Mesure de la libération d'ATPLes cultures cellulaires cultivées sur des lamelles de 12 mm ont été transférées dans des gobelets sur mesure (diamètre intérieur = 13 mm, épaisseur de paroi = 0,5 mm) et reposées dans un milieu de culture pendant 1 h dans l'incubateur. Cela a été suivi de deux lavages avec HBSS et d'une incubation avec HBSS (265 µL) contenant des particules d'oxyde de fer pendant 1 h à température ambiante. Au début de l'expérience, un échantillon de pré-stimulation (80 µL) a été prélevé et immédiatement congelé sur de la neige carbonique. Ensuite, la manipulation expérimentale a été effectuée et un échantillon post-stimulation (80 µL) a été prélevé et congelé sur de la neige carbonique.La concentration d'ATP dans les échantillons de milieu de culture cellulaire a été mesurée à l'aide d'un test (CellTiter-Glo, Promega) basé sur la réaction luciférine-luciférase. Plus précisément, chaque échantillon (20 µL) ainsi qu'une série de solutions étalons d'ATP (20 µL, 0–80 nM) ont été ajoutés à une plaque opaque de 384 puits (Greiner Bio One International), et chacun d'eux a été mélangé avec le réactif luciférine-luciférase (20 µL). La bioluminescence a été enregistrée à l'aide d'un système d'imagerie IVIS Lumina (PerkinElmer) et le nombre de photons a été converti en concentration d'ATP à l'aide de la courbe standard.
Livraison stéréotaxique de particules magnétiques
Les rats ont été anesthésiés avec une injection intrapéritonéale (i.p.) d'un mélange de kétamine (75 mg par kg de poids corporel) et de médétomidine (0,5 mg par kg de poids corporel). Après avoir placé la tête de l'animal dans un cadre stéréotaxique (David Kopf Instruments), une incision médiane sur le cuir chevelu a été pratiquée et de petits trous crâniens ont été percés, permettant d'injecter des particules magnétiques dans le tronc cérébral à l'aide d'une seringue de microinjection (5 µL, Model 75 RN, Hamilton Company) et une aiguille (jauge 26s, Small Hub RN, 43 mm, style point AS, Hamilton Company) à un débit de 0,05 µL min−1. Les coordonnées des injections (tableau S9, informations complémentaires) ont été sélectionnées en fonction de l'atlas stéréotaxique du cerveau de rat [70] et d'une étude précédente. [30] Les coordonnées utilisées chez les petits rats (80–120 g) ont été déterminées expérimentalement. Une fois les particules délivrées, la plaie a été suturée et l'animal a reçu de l'atipamézole (1 mg par kg de poids corporel, i.p.) pour inverser l'anesthésie et de la buprénorphine (0,03 mg par kg de poids corporel, i.p.) pour soulager la douleur.
Imagerie par résonance magnétique
Pour déterminer l'emplacement et le devenir des particules magnétiques une fois qu'elles ont été injectées dans le tronc cérébral de rats, une IRM a été réalisée sur le scanner IRM 9,4 T avec une bobine de volume de 72 mm de diamètre intérieur (RAPID Biomedical) pour la transmission par radiofréquence et un réseau à 4 canaux bobine de tête (RAPID Biomedical) pour la réception du signal. L'anesthésie a été induite avec 4 % d'isoflurane et maintenue avec 1,5 % d'isoflurane. La température corporelle a été maintenue avec un lit d'eau chauffé. La fréquence respiratoire et la température corporelle ont été surveillées respectivement à l'aide d'un capteur d'oreiller pneumatique et d'une sonde à thermistance rectale, tous deux connectés à un système de surveillance et de déclenchement compatible MR (SA Instruments). Une séquence d'écho de gradient pondérée en T2* a été utilisée : TE = 6,5 ms, TR = 2230 ms, angle de bascule = 56°, nombre de moyennes = 5, FOV = 28,8 mm × 28,8 mm, matrice = 192 × 192, épaisseur de tranche = 0,15 mm, distance intercoupe = 0 mm. Les images ont une résolution isotrope de 150 µm.
L'enregistrement affine des images IRM a été effectué à l'aide du logiciel NifTK.[71]
Les cultures cellulaires ont été fixées avec une solution tamponnée de paraformaldéhyde (PFA) à 4 % (VWR Chemicals) pendant 10 min à température ambiante, lavées deux fois avec du PBS et incubées avec un tampon de blocage (PBS avec 5 % de sérum d'âne, 0,3 % de Triton X-100 , tous de Sigma-Aldrich) pendant 1 h à température ambiante. Après avoir retiré le tampon de blocage, chaque culture a été incubée avec un tampon de dilution (PBS avec 10 mg mL-1 de BSA, 1 % de sérum d'âne, 0,3 % de Triton X-100 et 0,1 mg mL-1 d'azoture de sodium) contenant un ou plusieurs primaires anticorps pendant 1 h à température ambiante. Ensuite, chaque culture a été lavée trois fois avec du PBS et incubée avec le tampon de dilution contenant un ou plusieurs anticorps secondaires pendant 1 h à température ambiante. Une fois la coloration effectuée, chaque culture a été lavée trois fois avec du PBS et incubée avec une solution de 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) (PBS avec 2,86 µM de DAPI) pendant 5 min. Enfin, les échantillons ont été montés sur des lames de microscope à l'aide d'un milieu de montage histologique (Fluoroshield, Sigma-Aldrich).
Pour préparer des coupes de cerveau, les animaux ont été anesthésiés avec du pentobarbital sodique (60 mg par kg de poids corporel, i.p.) et ont subi une perfusion transcardiaque avec une solution saline et la solution tamponnée de PFA à 4 %. Une fois le cerveau disséqué, il a été immergé dans une solution tamponnée à 2% de PFA pendant une nuit, lavé deux fois avec du PBS et immergé dans du PBS avec 30% de saccharose (Sigma-Aldrich). Le tronc cérébral a ensuite été disséqué et sectionné (16 µm). Les coupes ont été montées sur des lamelles de 12 mm enduites de gélatine. Le protocole d'immunocoloration pour les coupes de tronc cérébral était le même que pour les cultures cellulaires, sauf que l'incubation avec les anticorps primaires consistait en 1 h à température ambiante suivie de 24 h à 4 °C.
Des images d'immunofluorescence de cultures cellulaires ont été acquises avec un microscope inversé Zeiss Axio Observer Z1. Des images d'immunofluorescence de sections de tronc cérébral ont été acquises avec un microscope confocal Zeiss LSM 880.
La microscopie électronique à balayage
Les cultures cellulaires ont été fixées avec un tampon contenant 0,1 M de cacodylate de sodium, 2 % de paraformaldéhyde et 1,5 % de glutaraldéhyde (pH 7,3, tous de Sigma-Aldrich) pendant une nuit à 4 °C, et postfixées avec un tampon contenant 0,1 M de cacodylate de sodium et 1 % d'osmium. tétroxyde (Sigma-Aldrich) à 4 °C pendant 30 min. Ensuite, les cellules ont été lavées avec un tampon cacodylate de sodium (0,1 M), rincées à l'eau distillée, déshydratées dans l'éthanol et séchées au CO2. Après cela, les échantillons ont été montés sur des talons en aluminium à l'aide de languettes adhésives en carbone et recouverts d'une fine couche d'or/palladium ou de carbone à l'aide d'une coucheuse à faisceau ionique (Gatan). Pour chaque culture, les images ont été acquises à un grossissement de 700 fois avec un microscope électronique à balayage à émission de champ JEOL JSM-7401F (JEOL Ltd.) à quatre positions, une dans chaque quadrant.
Stimulation magnétomécanique des astrocytes in vivo
Pour les expériences qui ont utilisé le scanner IRM comme dispositif magnétique, les animaux ont d'abord été anesthésiés avec de l'isoflurane (4 % pour l'induction, 1,5 % pour l'entretien) et la veine et l'artère fémorales ont été canulées pour obtenir un accès vasculaire. L'uréthane (Sigma-Aldrich, 1,3 g par kg de poids corporel) a été administré par voie intraveineuse (i.v.) et l'isoflurane a été arrêté. Une anesthésie adéquate a été assurée en maintenant des niveaux stables d'ABP et de fréquence cardiaque montrant une absence de réponse à un pincement de patte. La température corporelle a été maintenue avec un lit d'eau chauffé à 37,0 ± 0,5 °C. L'ABP, la température corporelle et la fréquence respiratoire ont été enregistrées avec le système de surveillance physiologique du scanner IRM. Pour les enregistrements de base, l'animal a été maintenu à la position "off" qui était à 0,66 m du bord de l'alésage du scanner. Pour appliquer le champ magnétique de la frange, l'animal a été déplacé vers la position "on" où sa tête était au bord de l'alésage du scanner.Pour les expériences utilisant le Magnetic Mangle, les animaux ont été anesthésiés à l'uréthane (induction : 1,3 g par kg de poids corporel, i.p. ; entretien : 10–25 mg par kg de poids corporel par heure, i.v.). L'artère fémorale et la veine ont été cathétérisées pour les mesures d'ABP et l'administration d'anesthésique, respectivement. La température corporelle a été maintenue à 37,0 ± 0,5 °C. Le MMS des astrocytes du tronc cérébral a été réalisé en déplaçant le Magnetic Mangle de sorte que les aimants entourent la tête de l'animal.
Pour calculer la MAP à partir du signal ABP, l'onde de chaque cycle cardiaque a été intégrée puis divisée par la durée du cycle. La fréquence cardiaque a été dérivée du signal ABP en calculant la fréquence des cycles cardiaques.
Analyses statistiques
Étant donné qu'aucune étude précédente sur les changements de pression artérielle induits par le MMS n'avait été menée, une estimation intermédiaire de la taille de l'échantillon a été effectuée après les premières expériences in vivo. Un groupe naïf et un groupe expérimental (injection d'une suspension à 0,5 mg/mL, POD1) avec une taille d'échantillon de 6 mesures dans chaque groupe ont donné une taille d'effet de 3,0 (d de Cohen). Sur la base de ces résultats, une taille d'échantillon minimale de 3 était requise pour qu'un test t bilatéral à deux échantillons ait une puissance de 0,9 au seuil de signification de 0,05. Par conséquent, une taille d'échantillon de 6 et 5 a été utilisée pour les expériences avec le scanner IRM et le Magnetic Mangle, respectivement. Les animaux ont été exclus si le lieu d'injection n'était pas ciblé ou si aucune ligne de base stable n'a pu être établie lors de l'enregistrement de la pression artérielle.
Les mesures de la libération d'ATP à partir des cultures d'astrocytes et les changements de pression artérielle et de fréquence cardiaque résultant du MMS in vivo ont été soumis à une analyse statistique.
- Pré-traitement des données. Pour les mesures de libération d'ATP, le changement de [ATP]e a été calculé en soustrayant le [ATP]e initial du [ATP]e après la manipulation expérimentale. Pour les expériences MMS in vivo, le changement de MAP (ΔMAP) a été calculé en soustrayant le MAP moyen pendant la période de pré-stimulation du MAP moyen pendant la période de stimulation, et le changement de fréquence cardiaque a été calculé en soustrayant le rythme cardiaque moyen pendant la période de pré-stimulation. -période de stimulation à partir de la fréquence cardiaque moyenne pendant la période de stimulation.
- Les données sont présentées sous forme de moyenne ± S.D. sauf dans la figure 3i, où la moyenne ± l'erreur standard est utilisée.
- La taille de l'échantillon est indiquée dans les légendes des figures et les tableaux supplémentaires correspondants.
- Méthodes statistiques. Le test t de Student bilatéral (α = 0,05) a été utilisé pour tester l'hypothèse nulle selon laquelle la valeur moyenne est égale à 0 ou l'hypothèse nulle selon laquelle la différence entre les moyennes de deux échantillons est de 0. Analyse de régression linéaire (α = 0,01 ) a été utilisé pour déterminer les effets d'une ou de plusieurs variables explicatives sur la variable de réponse.
- Logiciel. MatLab a été utilisé pour effectuer toutes les analyses statistiques.
A.V.G. et M.F.L. contribué à parts égales à ce travail. Ce travail a été soutenu par une subvention conjointe entre le Rosetrees Trust et la John Black Charitable Foundation (Grant No. A2200). M.F.L. a reçu un financement de la Brain Tumor Charity (Grant No. QfC_2018_10387); le centre d'excellence sur les tumeurs cérébrales Edinburgh-UCL CRUK (subvention n° C7893/A27590) ; Conseil de la recherche médicale (subvention n° MR/J013110/1) ; le CRUK & EPSRC Comprehensive Cancer Imaging Center à KCL et UCL (Grant No. C1519/A16463 et C1519/A10331). A.V.G. est chercheur principal du Wellcome Trust (Réf : 200893). T.L.K. est un EPSRC Early Career Fellow (Grant No. EP/L006472/1). MÂCHOIRE. est membre du Wellcome Trust & Royal Society Sir Henry Dale (Grant No. 204624/Z/16/Z). Les auteurs tiennent à remercier les Drs. Vitaly Kasymov, Plamena R. Angelova, P. Stephen Patrick, Thomas Snoeks, Peter S. Johnson et Bernard Siow pour leur contribution aux études pilotes. Les auteurs tiennent également à remercier Ted Walls pour la fabrication du Magnetic Mangle et Mark Turmaine pour son aide dans la microscopie électronique à balayage.
Conflit d'intérêt
Les auteurs ne déclarent aucun conflit d'intérêt.
Aucun commentaire:
Enregistrer un commentaire
Remarque : Seul un membre de ce blog est autorisé à enregistrer un commentaire.